藥品領域的微生物檢測

微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。
儀器有微生物限度檢查儀，集菌儀、無菌集菌器
微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；霉菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。
檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為單位報告，特殊品種可以小包裝單位報告。
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）。
檢驗時，應從2 個以上小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。
一般應隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上小包裝單位）的3 倍量供試品。
供試液的制備
根據供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基，不得超過1 小時。
除另有規定外，常用的供試液制備方法如下。
1.液體供試品
取供試品10ml，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1∶10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1∶10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊供試液制備方法的供試品
(1)非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1∶20 的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜，在140℃干熱滅菌2小時）和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5～10 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1∶10 的供試液。
(2)膜劑供試品
取供試品100cm2，剪碎，加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1∶10 的供試液。
(3)腸溶及結腸溶制劑供試品
取供試品10g，加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑）至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1∶10 的供試液。
(4)氣霧劑、噴霧劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1∶10 的供試液。
(5)貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。
(6)具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法如下。
①培養基稀釋法 取規定量的供試液，至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml 供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固，培養，計數。每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為1ml的菌落數，計算每1ml 供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。
②離心沉淀法 取一定量的供試液， 500 轉/分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合，用于細菌檢查。
③薄膜過濾法 見細菌、霉菌及酵母菌計數項下的“薄膜過濾法”。使用的設備集菌儀或者在微生物限度檢查儀
④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。
細菌、霉菌及酵母菌計數
計數培養基的適用性檢查
細菌、霉菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配制的培養基均應檢查。
菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0 代）。并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕
黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕
菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，培養18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，培養24～48 小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數為50～100cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，培養5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數50～100cfu 的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用，若保存在2～8℃可在24 小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。
適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養48 小時，計數；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養72 小時，計數；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養72 小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
結果判定 被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大于70%，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。